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论文写作模式-考察两种提取方法对酒黄柏中小檗碱含量影响

2021-06-01 13:15:20
作者:杭州千明

  考察两种提取方式对酒关黄柏中小檗碱含量高低产生的影响,检测炮制是否对关黄柏饮片中的小檗碱含量产生影响。方法:采用HPLC法测定通过色谱甲醇超声法和色谱甲醇加热回流法所提取的小檗碱含量,通过烘干法进行水分测定。结果:甲醇超声法测得的酒炙前后小檗碱含量分别为:1.0073 mg/g、3.6218mg/g。甲醇加热回流法测得的酒炙前后小檗碱含量分别为:3.1033mg/g、4.8036mg/g。含水量为8.28%小于11%,符合2015版中国药典第一部中关黄柏部分所规定的药材含水量范围。结论:结果表明甲醇加热回流提取工艺优于甲醇超声提取工艺。酒炙后小檗碱含量高于生品含量。

  中药材是我国用于治病救人的传统药材,其在我国的医药领域中有着极为长久的应用历史,占据着极其重要的地位,需要我们去继承并发展。随着先进科学技术的进步与创新亦使人们了解到中药材具有的有效治疗作用的重要物质基础与其复杂的化学成分密不可分,要了解其药效作用价值 侯先应了解其化学成分。通过长久的历史经验了解到中药材必须炮制后方可用药亦是中医指导用药的重要特点之一。根据相关研究表明,中药炮制对中药饮片的药效有重要的影响[1]。中药材的化学成分以及所具有的含量会随着中药炮制过程而发生相应的变化,其有效治疗作用及饮片质量也会发生相应的变化,这说明炮制后两者之间必然有重要的关联。中药材本身的性质是其自身理化性质的基础,中药材自身的性质特点会受到炮制的影响,即中药材的理化性质伴随着其本身性质所产生的炮制影响亦会发生相应的改变,因此会造成中药材中的化学成分及其相应含量的变化,对其治疗作用亦会产生相应的影响[2]。中药炮制有提高药物治疗效果、降低毒副作用、矫味除臭、提高药物净度,保证药物用药安全等目的。因此中药炮制原理的深入研究对中药治疗疾病等药用价值的提升有重要意义。目前我们应准确把握中药炮制原理的研究现状,以便使我们对中药炮制技术拥有更多的了解从而可以更加深入的探讨研究,创造出更多的科研成果。

  在新中国成立以后特别是改革开放以来,我国的传统医药技术取得显著进步的同时也面临着许多问题和严峻的挑战。在这段时间里,中药炮制工艺原理开始开展了系统的研究,中药炮制技术作为我国一项历史悠久的传统应用技术和我国中医药领域独具特色的优秀产业,有着蓬勃旺盛的发展前景和产业优势。长久的临床用药经验丰富了历史文献资料,为我国对中药炮制技术的研究提供了宝贵的理论依据。并通过结合现今的先进科学技术得以深入研究,得到突破。但当今炮制技术发展亦存在现代化管理不足导致的整体规范化不强,质量检验标准有待完善及中药炮制继承方面技术人才缺乏等严重的问题[3]。因此,在今后的炮制研究工作中需要进一步完善不足,努力克服困难以使得炮制技术得到更好的发展。

  1.1.2中药炮制的研究内容

  中药炮制有着悠久的历史,其文献资料繁杂分散,且炮制的方法和经验多是师徒相传,故而如今在现代方法继承上也多有所不同,因此研究人员应当更多的研究文献,查阅典籍,对比差异,掌握精华,去其糟粕。在古代传统方法的基础上,找出规律,发现新的炮制研究思路,真正做到古为今所用。

  对炮制原理的研究使我们更加清楚的知道炮制过程及方法对中药材的理化性质造成的影响,亦可知道研究炮制原理对中药炮制工艺的重要性,因此对炮制原理的研究也是当前的研究重点,应当重视并发展创新。由于现代先进科学技术的研究进步,炮制工艺亦能够与时俱进,先进的设备技术使得炮制工艺的发展方向更加机械化、自动化,并且具备能够最大限度的减少成本,节约药材的优点。由此可知其对炮制工艺机械设备的研究具有重要意义。此外通过炮制实验可以对中药材的质量标准进行讨论和研究,药材的纹理、气味、颜色都可以作为探查药材质量优劣、品种之间差异的指标。陈嘉谟总结“凡药制造,贵在适中”的理论充分表明炮制方法及过程对临床用药疗效的重要影响。因此其方法和过程是炮制研究的重要内容之一,除此外中药的质量对药材疗效也有着直接的影响,当前由于炮制传统经验的不统一性,使得很多地方及产业有着不同的炮制方法过程,导致对中药材的质量有着不同的检验标准,其质量检验标准的差异导致中药材炮制管理存在不足,故对该工艺技术的质量要求应当制定并归纳出统一的衡量标准,以使得中药材的临床治疗作用发挥到最佳水平。可以让中药材得以更好的发挥药效以达到治病救人的目的。

  1.1.3中药炮制机制的研究展望

  将现代科学先进的技术及其他科学的先进研究结果与中药炮制工艺技术相结合,会使得中药炮制工艺得以创新,取得优秀的研究成果和研究进展,其应用将更加广泛,有更好的产业前景。

  根据相关的炮制文献可知,有科研人员提出在网络药理学的基础上,利用大数据技术将药物的作用网络与生物学的网络相联系,使两种网络能够结合起来,以便建立一种“药物-靶点-疾病”的网络系统,通过该系统可以掌握药物所含有的复杂有效成分以及药物自身所含有的物理化学性质。这项技术的开发可以便于科研人员更好的研究中药炮制的机制[4]。此外还可以在仿生技术的基础上建立一种与中药材性味、疗效及药物自身有关的炮制机制:“性-效-物”机制。分析判断药物种类和质量的重要指标之一即使药物的性味,而炮制可以影响药物的性味,使其治疗效果发生相应的变化,利用现代电子舌、电子鼻的技术可以更精确的对药物的性味变化进行分析和判断,能够更好的了解其化学性质。在此炮制机制中能够更好的掌握中药材的治疗作用、物理化学性质以及药物自身的性味特点[4]。

  中药炮制机制的研究是基于中药质量标准的统一进行的,在未来的炮制机制研究中应当构建以中药炮制品种的质量为基础的炮制系统,以保证未来炮制机制研究的有序长远发展。

  1.2关黄柏概述

  1.2.1关黄柏简介

  关黄柏,为芸香科植物黄檗Phellodendron amurense Rupr.的干燥树皮,又名黄檗木、黄波椤。外观为黄绿色或淡黄棕色,较平坦,轻且质硬,在我国境内广泛分布,多于深山、小溪以及河的岸边生长[5],在东北省以及华北各省中产量丰富,另外在国内的其他地方省份也有所分布如宁夏、河南、内蒙古、安徽等[6]。

  关黄柏具有非常多的有效药用价值,在临床上应用亦很广泛,在2015版《中国药典》第一部中记载其可用于“湿热泻痢,黄疸尿赤,疮疡肿毒,湿疹湿疮”等疾病的治疗。其炮制后可起到增强疗效、减毒的目的,其不同的炮制品亦有功效的差异,如盐炙可以舒缓其苦燥之性,长于滋阴降火,其酒炙后可以减缓其药物疗效,使清湿热,利关节之功效有所增加。炒关黄柏可降低苦寒之性[7]。由于关黄柏是我国的传统中药材亦是临床常用药材,因此关黄柏的用量很大,这种状况也导致了关黄柏数量的急剧减少,其现如今是国家的二级保护植物。

  1.2.2关黄柏的化学成分

  1926年起日本学者村上义温等研究人员开始对关黄柏的化学成分进行研究,其主要化学成分为生物碱类、黄酮类、酚酸类、柠檬苦素类等,其中以生物碱最为重要。除以上成分外还含有萜类、甾体类、三萜类、木脂素类、香豆素类等成分[6]。

  1.2.2.1生物碱类

  从关黄柏中分离得到的生物碱包含有:盐酸小檗碱、木兰花碱[8]、药根碱、小檗红碱、黄柏碱、非洲防己碱、掌叶防己碱、巴马汀、四氢小檗碱、四氢巴马汀、四氢药根碱、氧化小檗碱、蝙蝠葛任碱、吴茱萸次碱、白鲜碱、7-羟吴茱萸次碱等[9]。如今国内对关黄柏活性成分研究以盐酸小檗碱为主,盐酸小檗碱是关黄柏中的重要且有效化学成分之一[10],在2015版《中国药典》的第一部中有所规定,对关黄柏的有效活性的成分进行研究时要以盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的含量作为标准对照,通过对以上两种化学成分的含量进行测定,以验证或得出相应的实验结果,盐酸小檗碱和盐酸巴马汀对关黄柏的药理作用研究具有重要价值。查阅相关文献可知关黄柏中小檗碱含量为0.474%~1.240%,盐酸巴马汀含量为0.516%~1.224%,药根碱含量为0.008%~0.043%[11]。但关黄柏中化学成分复杂,对其成分的研究方法仍在继续探索创新,Chen Yao[12]等研究人员突破固有的研究习惯,对化学成分的研究不止集中在生物碱的分析上,而是 侯次提出同时测定关黄柏中酚酸、生物碱、柠檬苦素三种化学成分含量的方法。

  1.2.2.2黄酮类

  黄酮类化合物是关黄柏中的主要成分之一,而它的提取位置主要是果实或树叶,分离得到的化学成分主要有黄柏苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素、山柰酚等[6]。根据有关的关黄柏文献可以知道,关黄柏中的总黄酮具有清除自由基的能力,而通过相关的技术来测定其对OH-、O2-、DPPH等自由基的清除能力,可以得出一个结论:关黄柏中的黄酮类化合物提取液清除DPPH自由基能力很强[11]。

  1.2.2.3酚酸类

  关黄柏中酚酸类的化合物主要有:阿魏酸、绿原酸、阿魏酰奎尼酸、甲酯类成分等[6]。

  1.2.2.3柠檬苦素类

  柠檬苦素类化合物亦是关黄柏中的主要化学成分之一,大多数芸香科植物中都含有此类化合物,关黄柏中的柠檬苦素类化合物大多都是具有呋喃环的三萜类化合物,其主要有黄白酮酸、黄柏酮、黄柏内酯等[13]。

  1.2.3关黄柏的药理作用

  关黄柏的药理作用与其特性和化学成分紧密相连,其药理作用主要为:抑菌、抗炎、抗痛风、降血糖、抗氧化、抗癌等。

  1.2.3.1抑菌作用

  郭崇婷[14]对关黄柏果实中的精油进行研究,证明该种中药材对沙氏门菌有一定程度的影响作用的。查阅相关文献,赵凌旭等人[15]将黄柏进行煎煮,并将以此种方式提取得到的水煎液进行检测,检测方式为体外抑菌试验。得出相关结论即黄柏的提取液在体外对金黄色葡萄球菌具有抑菌功效。

  1.2.3.2抗炎作用

  孙晖等[16]通过分离纯化关黄柏中的生物碱,利用动物实验进行研究,通过对大鼠前列腺注射辣椒素的方式构建慢性非细菌性前列腺炎(CNP)模型。研究结果表明关黄柏中的生物碱可以明显有效抑制CNP的发生和发展。由此说明黄柏中的生物碱具有明显的抑菌作用。

  1.2.3.3抗痛风作用

  关黄柏因其具有清体内之热、干燥除湿以及可以治疗疮伤,解毒等有效治疗功效,故有治疗抗痛风的有效功效。有相关研究人员通过建立动物模型来检测盐炙黄柏对其抗痛风作用的影响,结果表明炮制前后关黄柏均有良好的抗痛风功效[6]。

  1.2.3.4降血糖作用

  关黄柏中的盐酸小檗碱降血糖作用明显,Cong Liu[17]等人研究发现关黄柏中的盐酸小檗碱具有可以提高人体内所分泌的胰岛素的作用,而人体可通过自身的分泌作用或通过外界获取该物质来达到有效的降低血糖含量的治疗功效,其作用原理为影响葡萄糖的代谢来达到治疗疾病的目的。其作用机制为抑制线粒体和脂肪的生成。关黄柏中的盐酸小檗碱可以达到治疗糖尿病的目的是通过减少身体中的血糖含量来实现。

  1.2.3.5抗氧化作用

  关黄柏中的黄酮类化合物自身具有很强的抗氧化性,李铁纯等人[18]为了比较川黄柏和关黄柏中抗氧化性的能力而进行了实验,实验方法为流动注射化学发光法,经实验结果表明,两种黄柏均具备该种功效作用,且对两品种中的黄酮类化合物含量和抗氧化性能力进行对比,可知关黄柏皆低于川黄柏。

  1.2.3.6抗癌作用

  据相关研究发现,关黄柏中所含的小檗碱具有抗癌活性[6]。张天雷等人[19]在木兰花碱药效学研究基础上,研究木兰花碱对治疗前列腺癌的作用机制,经实验结果表明木兰花碱可以使前列腺癌细胞的增殖得到有效抑制,其原理是通过诱导22RV1前列腺癌细胞凋亡而实现。

  1.3关黄柏除药材外其他应用

  关黄柏可以作为药材制成丸剂、汤剂或与其他药材一起制成复方制剂来达到治疗疾病的目的,例如,利用关黄柏研制开发出临床上常用的治疗腹泻的药物,复方木香小檗碱片[5]。但关黄柏除了具有此作用外,还可以利用其内的多种有效化学成分而研制开发出护肤产品,关黄柏可作为化妆品的一种而起到美容养颜的功效,根据相关文献研究表明,关黄柏可以制成面膜在轻中度痤疮中应用,并具有明显的功效[20]。因其抑菌抗炎的药理作用还可广泛应用于湿疹的治疗中,有明显改善该症状作用[6]。

  1.4小檗碱的药理作用

  小檗碱是一种结晶状的粉末,颜色为黄色或者橙色是一种异喹啉类生物碱,在芸香科植物、小檗科植物以及毛茛科等植物中广泛存在,其别称为黄连素,可从黄柏、三颗针以及黄连等传统的中药材中提取得到,其溶解度为可在甲醇和乙醇以及水中微溶[21]。小檗碱在临床上广泛应用,可以用于治疗慢性结肠炎、阿尔兹海默症、类风湿性关节炎、肝癌、肿瘤等疾病,并具有使血糖降低、抗病原微生物、对心脏进行保护等功效[22-23]。

  1.4.1抗炎

  小檗碱的抗炎性药理作用在临床上应用范围很广,有相关研究表明,通过构建慢性结膜炎小鼠动物模型,可证明小檗碱对存在于动物结肠中所固有的一层中的CD4+T细胞内的细胞致死因子具有有效的抑制作用,该实验证明盐酸小檗碱对慢性结膜炎具有治疗作用[22]。赵俊等人[24]通过建立慢性阻塞性肺疾病动物模型实验,证明不同剂量的小檗碱均可抑制该疾病模型动物的气道炎症。

  1.4.2抗肿瘤

  小檗碱有着毒副作用较小,且购买成本较低的特点,该特点也使得更多的研究人员根据其药理作用而将其与抗肿瘤药物的研制联系在一起,为肿瘤疾病的治疗提供了新的思路以及新的可能[23]。

  小檗碱对多种肿瘤细胞均有抑制生长的作用,例如食管癌细胞[25],另有研究表明小檗碱对乳腺癌细胞亦有抑制作用[23]。

  1.4.3抗病原微生物

  小檗碱抗病原微生物作用明显,有抗细菌和真菌作用,对病毒亦有抑制作用,其可以抑制很多种类型的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,对金黄色葡萄球菌、鼠疫杆菌、溶血性链球菌等细菌均存在抑制作用。据相关文献表明,念珠菌是一种真菌,女性阴道念珠菌病可以通过小檗碱来进行抑制,得到有效的治疗和预防,在体外,小檗碱对其有抗抑制作用,能够使白念珠菌对抗真菌药物的敏感性得到提升,FM1株是流行性感冒病毒中的一种,小檗碱对该种病毒的抑制有明显的功效[23]。

  1.4.4降血糖

  据相关文献表明,有研究人员通过构建大鼠糖尿病疾病模型,并利用血糖测量仪对使用小檗碱进行治疗的大鼠治疗前以及治疗后的血液或脑脊液中的葡萄糖含量进行测定,证明了小檗碱有着降低血糖含量的药理作用[22]。

  1.5中药材提取方法

  1.5.1超声波辅助提取法

  超声提取法是指将药材饮片放入溶剂中,并利用超声波的辅助功能而进行提取的一种提取工艺,应用此方法对中药材进行提取具有快速省时、效率高的特点,并且药材中的有效成分不会在温度高的条件下受到损害[26]。在本论文中将关黄柏与辅助溶剂一同放入烧杯中可利用声波热效应、机械效应及空化效应[27]的作用使药材自身细胞毁坏,促使辅助溶剂进入关黄柏中。

  1.5.2加热回流法提取法

  加热回流提取法,是指以挥发能力强的有机溶剂为提取溶剂,将药材浸泡在其中,通过加热蒸馏的方式处理药材浸出液,馏出提取溶剂后对提取液进行冷却,反复实验步骤直至提取完全的方法。薛靓嫣等人[28]即利用此方法对黄连进行提取,检测水提取液的最佳提取因素。该方法是实验室常用的提取方法之一。

  1.5.3浸渍提取法

  该方法是指将药材的粉末或者块状置于适当的容器中,添加合适的溶剂,并将药材浸渍在溶剂中,以提取药材中有效成分的方法。屈欢等人[29]利用酸水浸渍法对黄连中的小檗碱进行提取并结合乙醇重结晶获得纯品的盐酸小檗碱,以对黄连中的该成分抑制黄连真菌方面进行探讨研究。利用浸渍法提取药材设备简易,方便可行,但浸出率一般不高。

  1.5.4半仿生提取法

  半仿生提取方法是指从生物药剂学的角度,将分子药物探究方法和整体药物的探究方法相结合,对口服药物在胃肠道中吸收以及运转的环境进行模拟,采用活性指导下的导向分离方法,该方法是一种新型口服给药提取技术,最先提出此概念的研究人员是张兆旺[27]。

  1.6研究目的与意义

  1.6.1目的

  关黄柏是临床广泛应用的常用药材,本文是为了考察甲醇超声提取方法和甲醇加热回流提取方法对关黄柏中小檗碱提取含量的影响,以分析和确定其中更好的提取工艺为目的。并检测炮制是否影响关黄柏饮片中有效成分的变化。

  1.6.2意义

  采用高效液相法测定小檗碱的含量,能够更好的控制中药饮片的质量为关黄柏饮片中小檗碱的含量测定提供有效的定量方法,使实验数据更加准确。本实验采用甲醇超声法和甲醇加热回流法两种提取工艺对酒炙前后关黄柏进行提取,通过比较含量差异为关黄柏的提取工艺质量标准提供了有效合理的参考价值,并为关黄柏的酒炙提供了基础的理论依据。

  2实验

  2.1引言

  中医药文化是我国优秀的传统文化,是中华民族数千年来的精华总结,亦是中华民族重要的组成部分。利用中药行医在我国有着丰富的历史临床经验,是值得我们去深思和探究的科学。关黄柏作为临床常用药材,对其药效和安全性的研究有重要意义。

  参考2015版中国药典以及相关文献,本实验以关黄柏中的盐酸小檗碱为研究对象。该物质在关黄柏中含量较高,药理活性广泛,因此本实验采用色谱甲醇超声法和色谱甲醇加热回流法对小檗碱进行提取,以对酒炙关黄柏的提取工艺进行优化。本实验亦检测了酒炙对关黄柏中小檗碱含量的影响,为进一步研究中药饮片的药理作用提供了理论参考依据。

  2.2仪器与试剂

  2.2.1实验材料

  该实验中所需的实验试剂和中药材见表2-1。

  表2-1实验所需的药材及相应试剂

  实验材料厂家

  关黄柏

  盐酸小檗碱标准品

  色谱甲醇天津市天力化学试剂有限公司

  黄酒

  乙腈天津市天力化学试剂有限公司

  磷酸天津市天力化学试剂有限公司

  水娃哈哈饮料有限公司

  2.2.2实验仪器

  实验所用仪器如表2-2所示。

  表2-2实验所需的仪器设备

  实验仪器厂家

  超声波清洗器(AS3120)深圳市洁盟清洗设备有限公司

  电热鼓风干燥箱(GZX-9240MBE)上海博讯实业有限公司

  电子分析天平(ME104E)梅特勒-托利多仪器有限公司

  电热恒温水浴锅(HH2)天津因特莱斯仪器有限公司

  高效液相色谱仪(ULtimate3000)赛默飞公司

  2.3实验内容与方法

  2.3.1酒炙黄柏

  称取关黄柏饮片5克,倒入相适应量的黄酒,搅拌均匀后使关黄柏饮片在黄酒中浸润30min,放入炒锅中炒干,火候应选取文火,后盛取炮制后的药材饮片,放凉即可[30]。

  2.3.2色谱条件分析

  色谱柱:Diamonsil C18(4.6mm×250mm,5μm);

  填充剂:十八烷基硅烷键合硅胶;

  流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液(50:50);

  流速:1.0ml/min;

  进样量:10μl;

  检测波长:345nm。

  柱温:室温

  2.3.3对照品溶液的制备

  准备10ml的容量瓶,准确称取所需要的盐酸小檗碱粉末10mg,将其放置于准备

  好的玻璃容器中,并向其中加入10ml的色谱甲醇,待摇晃均匀后,静置,制得的小檗碱对照品溶液浓度为1mg/ml。

  2.3.4供试品溶液的制备

  2.3.4.1色谱甲醇超声法提取制备

  (1)取生关黄柏饮片5g置烧杯中加入50ml色谱甲醇,放入超声仪器中超声30分钟,取出,用布氏漏斗进行抽滤,保留滤液,倒入容量瓶中标号为1。

  (2)取酒黄柏饮片5g置烧杯中加入50ml色谱甲醇,放入超声仪器中超声30分钟,取出,用布氏漏斗进行抽滤,保留滤液,置容量瓶中标号为2。

  2.3.4.2色谱甲醇加热回流法提取制备

  (1)准备100ml的容量瓶一只并称取生关黄柏饮片5g,将药材放入准备好的玻璃容器中,并向容器中加入50ml色谱甲醇,浸渍20分钟,回流加热30分钟,用布氏漏斗滤过。保留滤液,倒入50ml容量瓶中标号为3。

  (2)准备100ml的容量瓶一只并称取生关黄柏饮片5g,将药材放入准备好的玻璃容器中,并向容器中加入50ml色谱甲醇,浸渍20分钟,回流加热30分钟,用布氏漏斗滤过。保留滤液,倒入50ml容量瓶中标号为4。

  2.3.5标准曲线的绘制

  移取2.3.3项下对照品溶液1ml,通过0.45μm微孔滤膜滤过,置于进样瓶中,放入高效液相色谱仪,进样量分别为0.5μl、1μl、2μl、4μl、6μl、8μl、10μl对应进样质量分别为:0.5μg、1μg、2μg、4μg、6μg、8μg、10μg。后按照规定的色谱条件进行测定,分别记录小檗碱的峰面积,以对照品溶液的进样质量(μg)为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线,得到回归方程,相关系数关系及线性范围。

  2.3.6方法学考察

  2.3.6.1精密度考察

  抽取1mg/ml浓度的对照品溶液1ml,用0.45μm微孔滤膜滤过,置进样瓶中,连续进样6次每次进样量为6μl,按规定的色谱条件进行测定,记录峰面积并根据峰面积计算其RSD值[31-32]。

  2.3.6.2稳定性考察

  抽取1mg/ml浓度的对照品溶液1ml,用0.45μm微孔滤膜滤过,置进样瓶中,所得滤液分别于室温下在0、2、4、6、8、10h进样,每次进样量为4μl,按规定的色谱条件进行测定,记录峰面积并根据峰面积计算RSD值[31-32]。

  2.3.6.3重复性考察

  精密抽取3号供试品溶液6份,用0.45μm微孔滤膜滤过,置于进样瓶中,按规定的色谱条件进行测定,记录峰面积,计算小檗碱的含量及含量的RSD值[31-32]。

  2.3.6.4加样回收率考察

  精密称定供试品6份,分别添加适量的对照品粉末,按2.3.4.2项下的供试品溶液处理方法制备成6份样品溶液,分别放入10ml容量瓶中,再用色谱甲醇定容至10ml,将容量瓶内试液用0.45μm微孔滤膜过滤,按照规定的色谱条件测定,分别进样10μl,记录小檗碱峰面积,计算加样回收率及RSD值。

  2.3.7样品的测定

  分别用注射器抽取标号为1、2、3、4的供试品溶液的滤液1ml,通过0.45μm微孔滤膜滤过,置于进样瓶中,放入高效液相色谱仪中并按规定的色谱条件进行测定,记录峰面积。并通过回归方程计算小檗碱的平均含量。

  2.3.8关黄柏中水分的测定

  取关黄柏饮片2.1553g,平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中,厚度不超过10mm,精密称定,开启瓶盖在100到150℃的范围内干燥5小时,将瓶盖盖好,移置干燥器中,放冷30分钟,精密称定,在上述温度下干燥1小时,放冷,称重,至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量,计算关黄柏饮片中的含水量(%)。

  2.4实验结果与讨论

  2.4.1线性关系考察

  如表2-3所示为盐酸小檗碱对照品线性关系考察结果,如图2-1所示为以盐酸小檗碱的进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标制成的标准曲线,得小檗碱线性方程为y=52.86x+1.6035,r=0.9999,结果表明盐酸小檗碱的进样质量在0.5μg-10μg之间的线性关系良好(n=7)。如图2-2至图2-8所示的是进样量分别为0.5、1、2、4、6、8、10μl的盐酸小檗碱对照品溶液的HPLC图谱。

  表2-3盐酸小檗碱对照品线性关系考察结果(n=7)

  样品编号进样质量(μg)峰面积

  1 0.5 27.7227

  2 1.0 52.6585

  3 2.0 107.3027

  4 4.0 216.3118

  5 6.0 318.9668

  6 8.0 423.9638

  7 10.0 529.3947

  图2-1小檗碱对照品标准曲线图

  图2-2 0.5μl对照品溶液色谱图

  图2-3 1μl对照品溶液色谱图

  图2-4 2μl对照品溶液色谱图

  图2-5 4μl对照品溶液色谱图

  图2-6 6μl对照品溶液色谱图

  图2-7 8μl对照品溶液色谱图

  图2-8 10μl对照品溶液色谱图

  2.4.2精密度考察实验

  如图2-9至图2-14为盐酸小檗碱精密度测得的HPLC图谱,表2-4为盐酸小檗碱的峰面积结果,根据其峰面积计算得:小檗碱精密度的RSD值为0.60%(n=6),本实验精密度良好。

  表2-4盐酸小檗碱的精密度实验结果(n=6)

  样品编号峰面积平均峰面积RSD值(%)

  1 317.0847 318.0720 0.60

  2 318.1130

  3 320.9588

  4 319.6722

  5 316.4833

  6 316.1200

  图2-9盐酸小檗碱精密度考察1号色谱图

  图2-10盐酸小檗碱精密度考察2号色谱图

  图2-11盐酸小檗碱精密度考察3号色谱图

  图2-12盐酸小檗碱精密度考察4号色谱图

  图2-13盐酸小檗碱精密度考察5号色谱图

  图2-14盐酸小檗碱精密度考察6号色谱图

  2.4.3稳定性考察实验

  如图2-15至图2-20所示为盐酸小檗碱稳定性考察测得的HPLC图谱,盐酸小檗碱峰面积见表2-5,计算盐酸小檗碱稳定性峰面积得到其RSD值为0.31%(n=6),本实验稳定性良好。

  表2-5盐酸小檗碱稳定性实验结果(n=6)

  样品编号峰面积平均峰面积RSD值(%)

  1 212.2136 212.7628 0.31

  2 213.5830

  3 212.4427

  4 212.4427

  5 213.6346

  6 212.2604

  图2-15稳定性实验0h进样色谱图

  图2-16稳定性实验2h进样色谱图

  图2-17稳定性实验4h进样色谱图

  图2-18稳定性实验6h进样色谱图

  图2-19稳定性实验8h进样色谱图

  图2-20稳定性实验10h进样色谱图

  2.4.4重复性考察实验

  如图2-21至图2-26所示为通过甲醇加热回流提取工艺对生关黄柏饮片进行提取得到的盐酸小檗碱在重复性实验所得的HPLC图谱,其盐酸小檗碱峰面积测得数据见表2-6,经计算得盐酸小檗碱重复性峰面积的RSD值为0.70%(n=6),结果显示生关黄柏重复性良好。

  表2-6盐酸小檗碱重复性实验结果(n=6)

  样品编号称样量

  (g)峰面积含量

  (mg/g)平均含量(mg/g)RSD值

  (%)

  1 5.0123 151.0513 3.0749 3.0838 0.70

  2 5.0157 152.0456 3.0933

  3 5.0156 153.0152 3.1133

  4 5.0143 150.5631 3.0636

  5 5.0153 150.3566 3.0588

  6 5.0161 152.3265 3.0988

  图2-19盐酸小檗碱重复性实验1号色谱图

  图2-20盐酸小檗碱重复性实验2号色谱图

  图2-21盐酸小檗碱重复性实验3号色谱图

  图2-22盐酸小檗碱重复性实验4号色谱图

  图2-23盐酸小檗碱重复性实验5号色谱图

  图2-24盐酸小檗碱重复性实验6号色谱图

  2.4.5加样回收率考察实验

  如图2-25至图2-30所示为通过甲醇回流提取工艺对生关黄柏饮片进行提取得到的盐酸小檗碱在加样回收率实验中所得的HPLC图谱,实验结果如表2-7所示,经计算得盐酸小檗碱的加样回收率为98.59%,RSD值为0.85%(n=6),结果表明该方法的准确度良好。

  表2-7盐酸小檗碱的加样回收率实验结果(n=6)

  供试品取样量(g)供试品含量

  (mg)加入对照品量(mg)实际测得量

  (mg)加样回收率(%)平均加样回收率(%)RSD值

  (%)

  0.5123 1.5798 1.6000 3.1750 99.70 98.59 1.70

  0.5157 1.5903 1.6000 3.1479 97.35

  0.5150 1.5882 1.6000 3.1662 98.63

  0.5143 1.5860 1.6000 3.1207 95.92

  0.5153 1.5891 1.6000 3.1811 99.50

  0.5161 1.5915 1.6000 3.1982 100.42

  图2-25盐酸小檗碱加样回收率实验1号色谱图

  图2-26盐酸小檗碱加样回收率2号色谱图

  图2-27盐酸小檗碱加样回收率3号色谱图

  图2-28盐酸小檗碱加样回收率4号色谱图

  图2-29盐酸小檗碱加样回收率实验5号色谱图

  图2-30盐酸小檗碱加样回收率实验6号色谱图

  2.4.6样品含量测定

  2.4.6.1甲醇超声法提取生关黄柏中小檗碱含量

  甲醇超声法提取生关黄柏中盐酸小檗碱含量结果如表2-8所示,盐酸小檗碱高效液相色谱图如图2-31所示,生关黄柏饮片中测得的盐酸小檗碱的含量为1.0073mg/g(n=3)。

  表2-8盐酸小檗碱含量测定结果(n=3)

  样品编号含量(mg/g)平均含量(mg/g)RSD值(%)

  1 1.0087 1.0073 0.94%

  2 1.0160

  3 0.9972

  图2-31盐酸小檗碱含量色谱图

  2.4.6.2甲醇超声提取酒炙关黄柏中小檗碱含量

  甲醇超声法提取酒炙后关黄柏中盐酸小檗碱含量结果如表2-7所示,盐酸小檗碱高效液相色谱图如图2-32所示,酒炙后关黄柏饮片中测得的盐酸小檗碱的含量为3.6218mg/g(n=3)。

  表2-7盐酸小檗碱含量测定结果(n=3)

  样品编号含量(mg/g)平均含量(mg/g)RSD值(%)

  1 3.6557 3.6218 0.96%

  2 3.6238

  3 3.5859

  图2-32盐酸小檗碱含量色谱图

  2.4.6.3甲醇回流法提取生关黄柏中小檗碱含量

  甲醇回流法提取生关黄柏中盐酸小檗碱含量结果如表2-8所示,盐酸小檗碱高效液相色谱图如图2-33所示,生关黄柏饮片中测得的盐酸小檗碱的含量为3.1033mg/g(n=3)。

  表2-8盐酸小檗碱含量测定结果(n=3)

  样品编号含量(mg/g)平均含量(mg/g)RSD值(%)

  1 3.1407 3.1033 1.19%

  2 3.1025

  3 3.0667

  图2-33盐酸小檗碱含量色谱图

  2.4.6.4甲醇回流法提取酒炙关黄柏中小檗碱含量

  甲醇回流法提取酒炙后关黄柏中盐酸小檗碱的含量结果如表2-9所示,盐酸小檗碱的高效液相色谱图如图2-28所示,酒炙后关黄柏饮片中测得的盐酸小檗碱的含量为4.8036mg/g(n=3)。

  表2-9盐酸小檗碱含量测定结果(n=3)

  样品编号含量(mg/g)平均含量(mg/g)RSD值(%)

  1 4.8136 4.8036 0.71

  2 4.8315

  3 4.7657

  图2-34盐酸小檗碱含量色谱图

  2.4.7水分的测定

  盐酸小檗碱的水分测定结果见表2-10,经计算得到该饮片中水分含量为8.28%。

  表2-10关黄柏饮片水分测定

  实验恒重后容器

  质量(g)干燥前药品与容器总质量(g)干燥后药品与容器总质量(g)含量(%)

  水分22.6261 24.6044 24.6030 8.28

  2.5讨论

  2.5.1提取方法的选择

  关黄柏是一种临床常用药材,通过对其提取方法进行优化可以使其内的有效成分最大限度的被利用。本实验的研究对象是关黄柏中的盐酸小檗碱,是生物碱类化合物,因此,盐酸小檗碱可在甲醇、乙醇中溶解[33],故可用醇提法作为实验的提取方法,分析甲醇的极性大于乙醇,因此小檗碱在甲醇中的溶解度大于在乙醇中的溶解度,而且乙醇的沸点高于甲醇,故本实验采用甲醇作为提取溶剂。提取工艺采用超声波辅助提取法具有方便、简单,效率高等优势[34]。赵伟杰[35]利用超声波辅助技术以对川黄柏中的小檗碱进行提取来优化方案,为本文进行超声提取提供了思路。加热回流法提取设备简单、提取效率高,适合耐高温化学成分的提取,醇回流提取是实验室常用的一种提取方法[24]。

  2.5.2酒炙后小檗碱含量分析

  关黄柏饮片经酒炙后其含量发生变化,酒炙后小檗碱含量高于生品的含量。分析原因为将药材放入黄酒后,关黄柏的组织细胞被溶剂浸润渗透,由于黄酒对生物碱有较大的溶解度而使生物碱在药材组织细胞内形成溶液,该溶液分布在饮片的各个部位,从而使黄酒溶解的小檗碱在其挥发后存在于饮片的各部位,有利于有效成分的提取[30]。

  2.5.3色谱图分析

  对本实验的色谱图进行分析,可以发现线性关系考察中进样量为0.5μl、1μl时未出现拖尾现象,从2μl开始逐渐拖尾,分析可能是由于色谱柱受到污染;其他方法学考察以及样品含量测定得到的色谱图中除甲醇超声法提取的生品含量色谱图未出现拖尾现象外,其余的色谱图均出现拖尾现象。且比较色谱图,可观察到不同的提取方法以及炮制过程对药材中有效成分及含量有明显影响,并且甲醇超声提取法峰型优于甲醇加热回流提取法测得峰型,生关黄柏饮片峰型优于酒炙后关黄柏饮片测得的峰型。分析造成此现象的关键因素为温度,药材加热后会对关黄柏中有效成分的结构以及其在饮片中的分布状态造成影响,炮制可能使小檗碱转化为小檗红碱导致有效成分极性发生变化。

  2.5.4炮制操作方法对小檗碱含量影响

  炮制会对药材饮片中有效成分的含量造成影响,其操作步骤的差异亦会导致小檗碱含量测定的差异。关黄柏酒炙过程中,黄酒的浸润时间、浸润量、翻炒程度、火候要求等均是小檗碱含量的影响因素。在炮制过程中,药材表面炒干至颜色变深即可,时间不要太久否则成炭制品影响有效成分的含量,根据相关文献可知,在黄柏的炮制方法中,黄柏炭中的小檗碱含量最低,黄柏炒炭会使小檗碱稳定性受到影响[30]。炭制品由于高温会使小檗碱转化为小檗红碱。通过预试验发现关黄柏浸泡30分钟效果较好,浸泡时间过短,溶剂不能充分渗透,会影响有效成分提取率。